大腸埃希氏菌25123工作菌株 D0011(YY/T 0689-2008/YY/T 1497-2016/YY/T1777)
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金黃色葡萄球菌6538染菌玻片 A0240
CICC A0240 | 5×10^5~5×10^6 CFU/片
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短小芽胞桿菌E601芽胞懸液 A0060
CICC A0060 | 芽胞含量:108CFU/mL
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巴西曲霉16404染菌玻片 A0230
CICC A0230 | 5×10^5~5×10^6 CFU/片
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枯草芽胞桿菌6633芽胞懸液 A0050
CICC A0050 | 芽胞含量:106CFU/mL
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萎縮芽孢桿菌9372染菌玻片 A0220
CICC A0220 | 5×10^5~5×10^6 CFU/片
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本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中致瀉大腸埃希氏菌的檢驗(yàn),包括EPEC(腸道致病性)、EIEC(腸道侵襲性)等五種致病型[4]。
采用選擇性培養(yǎng)基分離結(jié)合PCR技術(shù),包括增菌培養(yǎng)、生化鑒定及血清學(xué)試驗(yàn),PCR儀用于特異性基因片段擴(kuò)增[4]。
檢測靈敏度為1 CFU/25g,定量方法依賴平板計(jì)數(shù)法與實(shí)時(shí)熒光定量PCR聯(lián)合判定[4]。
需使用標(biāo)準(zhǔn)菌株(如ATCC 35150)作為陽性對(duì)照,陰性對(duì)照需排除交叉污染,每批次實(shí)驗(yàn)需包含空白對(duì)照[4]。
1. 樣品預(yù)處理與選擇性增菌(36℃±1℃, 18-24h);
2. 分離培養(yǎng)(MAC/EMB瓊脂);
3. 生化鑒定(吲哚、MR-VP試驗(yàn));
4. PCR檢測毒力基因(stx1/stx2等)[4]。
需區(qū)分不同致病型的毒力因子,如EHEC需檢測志賀毒素基因,實(shí)驗(yàn)人員需具備生物安全二級(jí)防護(hù)資質(zhì)[4]。
適用于食品及其加工環(huán)境中大腸埃希氏菌的定量檢測,包括生鮮食品、預(yù)包裝食品及加工器具表面樣品[1]。
基于平板計(jì)數(shù)法,采用ChromID?大腸桿菌顯色培養(yǎng)基,結(jié)合β-葡萄糖醛酸酶活性檢測[1]。
最低檢出限為1 CFU/g(mL),定量范圍10-300 CFU/平板,超出范圍需梯度稀釋[1]。
每批次需包含標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25922作為陽性對(duì)照,并設(shè)置基質(zhì)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)(回收率≥70%)[1]。
1. 樣品均質(zhì)與十倍梯度稀釋;
2. 選擇性平板接種(37℃±1℃, 24h±2h);
3. 典型菌落計(jì)數(shù)(藍(lán)色/綠色菌落);
4. 確證試驗(yàn)(氧化酶陰性、IMViC++--)[1]。
顯色培養(yǎng)基需進(jìn)行適應(yīng)性驗(yàn)證,冷凍樣品需在45℃內(nèi)快速解凍,檢測報(bào)告需注明未經(jīng)驗(yàn)證的方法學(xué)偏差[1]。
針對(duì)進(jìn)出口食品中EHEC、ETEC、EPEC、EIEC、EAEC五類致瀉菌的快速篩查,檢測周期≤8h[2][4]。
多重PCR技術(shù)同步檢測lt/stx/eae等毒力基因,擴(kuò)增體系包含內(nèi)標(biāo)控制,電泳判定需出現(xiàn)特異性條帶[2][4]。
純菌DNA檢測限為10 pg/μL,食品基質(zhì)中靈敏度達(dá)10^3 CFU/g[2][4]。
每批次需包含非目標(biāo)菌(如沙門氏菌)作為特異性對(duì)照,擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)需顯示正常條帶排除抑制[2][4]。
1. 快速DNA提取(煮沸法);
2. 多重PCR擴(kuò)增(95℃預(yù)變性5min,35循環(huán));
3. 瓊脂糖凝膠電泳分析(1.5%凝膠,100V 40min)[2][4]。
需注意引物二聚體干擾,陽性結(jié)果需經(jīng)測序確認(rèn),方法不適用于死菌檢測[2][4]。
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